华中农大近期科学研究进展

 新闻资讯     |      2019-11-28 10:41

  近日,华中农大和美国明尼苏达大学合作解析了玉米自然群体中的DNA甲基化变异,揭示了DNA甲基化变异的遗传基础以及DNA甲基化变异与基因表达和表型的关联。该成果发表在开放获取期刊Genome Biology上。

  DNA甲基化对植物的生长发育和环境响应起着十分重要的作用。作为一种较为稳定的遗传信息,DNA甲基化既可由DNA序列变异诱发,也可独立于DNA序列产生纯表观遗传变异,这种独立的程度和DNA甲基化对基因表达以及表型变异的影响一直是研究热点。

  近年来,高通量测序技术和基因型检测技术的发展极大促进了作物遗传改良,育种家可以根据大量的SNP数据建立模型,预测表型和进行基因组选择,这一做法的前提是性状变异由DNA序列变异(SNP)决定。但是,对于很多性状,DNA序列变异通常只能解释部分的遗传力,仍有相当一部分遗传力无法被解释,许多学者将这种现象称为“消失的遗传力”,如何寻找并利用这部分遗传力是遗传学家和育种学家面临的一个重大挑战。表观遗传变异指不依赖于DNA序列的、可引起基因表达变化、并可遗传给后代的变异,包括DNA甲基化等染色质修饰。

  研究表明,DNA甲基化在玉米不同基因型间存在巨大变异,但是,由于玉米基因组复杂和测序成本高,一直缺乏高通量低成本DNA甲基化检测技术,因而无法在群体水平研究DNA甲基化变异的程度及其生物学功能。

  本研究中,研究人员拓展了前期开发的液相探针捕获技术(Li等, Nucleic Acids Research, 2015, 43:e81),包括了更多的DNA甲基化变异区段,这些区段的选择基于研究人员前期对玉米基因组DNA甲基化的研究成果,包括了基因组中最有可能发生DNA甲基化变异、影响基因表达或产生表型、同时又能被有效监测的区段。基于这一技术,研究人员对263份来自热带、亚热带和温带的玉米自交系的DNA甲基化进行了分析,寻找到了大量DNA甲基化差异区段(Differentially methylated region, DMR),结合高密度SNP数据、叶片和籽粒基因表达数据以及籽粒代谢数据,解析了DNA甲基化变异的遗传基础及其对表型变异的影响。

  研究发现,DNA甲基化变异广泛存在,且绝大多数变异(>

  60%)不与DNA序列变异关联,同时发现DNA甲基化变异对基因表达的影响依赖于组织和序列环境。此外,DMR与代谢性状的关联分析发现约16%的性状与DMR显著关联,有趣的是,与性状关联的DMR中超过半数不与SNP关联,且有些性状只与DMR关联而不与SNP关联,提示DNA甲基化携带了特有的遗传信息。

  本研究系统解析了DNA甲基化变异的遗传基础,并证明DNA甲基化可调控基因表达和表型,为解释消失的遗传力提供了新的支持。这是第一次在群体水平分析作物中DNA甲基化的变异和功能。

  华中农大生科学院博士研究生徐静和陈果为共同第一作者,李青教授和明尼苏达大学Nathan Springer教授为论文共同通讯作者,严建兵教授和李林教授参与了相关研究工作。该研究得到国家重点研发计划、华中农业大学科研启动经费和华中农业大学自主科技创新基金等的资助。

  近日,植物学领域国际学术期刊Trends in Plant Science以Feature Review的形式在线发表了华中农大棉花团队关于植物基因编辑的长文综述,系统阐述了CRISPR/Cas9基因编辑系统在大田农作物、水果和蔬菜中的应用,重点探讨了该技术体系的作用机制、特异性、编辑效率、局限性以及未来挑战。同时,该文还对如单碱基编辑系统、xCas9、Cas12a (Cpf1)和Cas13等目前新兴的其它基因组编辑工具在植物中的应用前景提出了独特的观点。

  基因编辑技术是指在基因组水平上对DNA序列进行定点改造的遗传操作技术,是近几年发展起来的生命科学领域的革命性、颠覆性技术,已连续多年入选国际顶级科学刊物Nature/Science评选的“世界十大科学进展”。目前应用比较广泛的基因编辑技术主要有ZFN, TALEN, CRISPR等三种。而自 2013 年在真核生物中成功应用以后,CRISPR/Cas9 系统成为生命科学研究的关注热点和近年来最受欢迎的基因组编辑系统。该系统具有稳定性强、效率高和操作简单的特点。利用 CRISPR/Cas9 技术能够成功实现基因组水平的基因敲除,基因转录调控和修饰等。当前以CRISPR为代表的植物基因编辑技术有望引发现代农业科技中作物育种和农业生物技术研发的革命,彻底颠覆传统育种方式。

  时间回到2012年,刚刚从美国做完博士后研究回国的金双侠教授着手建立棉花的功能基因组研究技术平台,起初,团队把研究重点放在传统的农杆菌T-DNA插入创造突变体上,经过大量实践证明传统T-DNA插入技术不适用与棉花功能基因组研究,原因在于目前生产上种植的棉花是异源四倍体,有 52 条染色体,基因组庞大、复杂,同源重复序列多,同一基因也具有多个拷贝,目前很难获得有效的单基因突变体,而且棉花基因组庞大,如果要实现单个基因的饱和敲除,需要获得180万个独立的T-DNA插入株系,这是现有的技术条件、物质条件下几乎不可能完成的任务。

  在张献龙教授的支持下,团队成员迅速调整方向,尝试将当时新兴TALEN技术引入到棉花功能基因组研究中,踏上了棉花基因组编辑的研究的征程。随后团队见证CRISPR强大的优势,迅速调整方向,尝试将水稻、拟南芥中的CRISPR编辑体系引入棉花当中,但实验结果总是不尽人意。棉花作为异源四倍体植物,有其自身的特性,为何不能将调控元件改为棉花自身的元件?随后通过对引导RNA启动子进行了替换,正式建立了棉花基因编辑系统,编辑效率高达85%以上,可以和水稻等模式植物中的编辑效率相媲美,相关系统不仅应用于国内棉花研究团队,更是推广到美国、澳大利亚等国内外100多个实验室。

  团队利用全基因测序的方法对基因编辑在植物中的的脱靶效应进行了系统研究,证明棉花基因编辑系统非常精准、脱靶率极低,为棉花基因编辑的推广应用又扫平一个障碍。随着生物信息学的发展,棉花团队定位到很多SNP位点,如何通过基因编辑的方法实现单个碱基的突变成为了团队面临的新挑战,棉花团队迅速与中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞团队合作首次实现了棉花单碱基编辑。

  但是挑战依然存在,如何实现在棉花基因组高效定点敲入目标序列一直是一个难题,博士生李波首次报道了Cpf1在棉花编辑中的应用,相较于Cas9,Cpf1切割产生的粘性末端将有利于实现棉花基因组定点敲入。正是这一系列扎实的研究工作,引起了国内外同行的广泛关注,今年4月,Trends in Plant Science主编Susanne Brink博士主动邀请棉花团队撰写植物基因编辑的长文综述并将这篇论文列为本年度的Feature Review, Feature Review是Trends in Plant Science 杂志发表的各种文章类型中数量最少、篇幅最长、影响力最大的文章类型。

  CRISPR-Cas9基因组编辑技术依赖于PAM序列及sgRNA和靶DNA的碱基互补配对来识别靶位点。PAM序列依赖性很大程度上限制了基因组上可被编辑的位点。基于CRISPR-Cas9系统的一些衍生工具如碱基编辑,PAM序列依赖性对靶向范围的限制更大。尽管近些年已经挖掘了很多识别不同PAM序列的Cas9蛋白或者变体用于基因组编辑,但是它们大都识别较为复杂的PAM序列,应用范围受限。xCas9和SpCas9-NG是最近报道的两个Cas9蛋白变体,它们识别更加简化的NG PAM序列,因此能更有效地缓解PAM限制性问题。

  核酸酶Cas9及其变体切割DNA产生的平末端对于插入外源基因存在效率低下的问题,最近开发的CRISPR-Cas12a(Cpf1)与CRISPR / Cas9相比,Cpf1分子量更小,仅需一个小RNA分子、脱靶效率更低、剪切位点离PAM很远且产生便于DNA插入的黏性末端等优势。最近,EnAsCas12a更是进一步提高了多重基因编辑、单碱基编辑以及内源基因活化的效率。

  基因组的编辑往往是不可逆的过程,在植物的生长过程中要应对复杂的外界条件,基因组水平的编辑就存在一定的局限性,如何在不改变基因组的条件下实现RNA的编辑显得尤为重要。CRISPR - Cas13,作为RNA引导的RNA编辑器,可以特异性靶向并切割病毒RNA和真核细胞中的内源RNA。目前,植物中已成功利用该系统抗马铃薯病毒(RNA病毒)。最近,张锋团队利用失活的Cas13将RESCUE引导到RNA转录本中的目标胞嘧啶碱基上,完成C到U的转化,更是证明了CRISPR / Cas13作为RNA 编辑器的广阔应用前景。

  核酸酶小型化一直是基因编辑研究领域的重要内容,小型化改造将有利基因编辑系统的递送。CRISPR-Cas14a,能够结合并切割单链DNA的目标序列。其大小约是其他Cas蛋白的一半。与Cas9不同,高德娱乐登录Cas14不需要识别PAM序列。另外,识别单链DNA方面比Cas13或Cas12更具特异性。因此,CRISPR/Cas14a在抗植物单链DNA病毒具有巨大的潜力。

  碱基编辑(Base Editing ,BE)可在不需要供体DNA模板或不产生DSB,甚至不依赖于HDR和NHEJ修复途径的情况下,在靶标上引起精确且可预期的核苷酸变化。

  目前 CRISPR/Cas9 在植物基因组编辑中的应用主要包括基因功能研究和作物遗传改良,编辑形式可分为功能基因的敲除、基因 (片段) 的定点插入或替换、欧亿3总代单碱基编辑和基因表达调控。CRISPR/Cas9系统已成功应用许多主要作物上,如拟南芥,水稻,小麦,玉米,大豆,高粱,棉花,油菜籽,大麦,本氏烟草,番茄,马铃薯,甜橙,黄瓜,生菜,矮牵牛,葡萄,苹果,欧亿3注册木薯,西瓜等。以小麦为例,小麦基因工程以高难度著称,部分原因是许多小麦株系都是“六倍体”,传统技术难以同时将多拷贝基因进行突变纯和。而通过基因编辑技术将小麦3组基因组上的MLO基因全部敲除,使得基因编辑小麦获得持久、广谱的白粉病抵抗能力。基因编辑多位点编辑的优势同样在二倍体的水稻育种中拥有无限的潜力,科研人员利用CRISPR/Cas9系统在水稻育种中间材料中同时编辑多个抗性和育性基因,成功将具有优良性状的育种中间材料快速开发成优质多抗的两系不育系,不仅显著加快了不育系的,而且有利于杂种优势的利用。利用CRISPR-Cas基因编辑技术,育种人员可以将自然存在的糯玉米性状直接引入最优秀的杂交品种中,培育出与传统玉米非常相似的新产品,解决了糯玉米产量低的问题。植物基因编辑技术让作物育种人员的工作更有效率且更精准。

  文中对于CRISPR/Cas系统未来的发展由难到易(从基因定点敲入到基因定点敲除)分别做了不同的描述,同时也是棉花基因编辑团队攻克的研究方向。过去转基因备受争议,除了外源基因的安全性问题以外,插入位点的不确定性同样是转基因安全问题之一,同时插入位点的差异不仅仅导致外源基因表达效率存在差异,也对插入位点附近的序列产生不可预测的影响,为目标性状研究带来极大的不确定性,因此如何实现序列定点敲入是植物基因编辑技术领域的桂冠。

  尽管CRISPR / Cas9系统是一种强大的基因编辑工具,但依然存在很多局限性。如:编辑效率,脱靶问题,PAM限制,同源重组效率低下,以及如何提高转化效率降低转化成本以及核酸酶小型化问题等等。同时,基因编辑技术的出现为作物分子育种提供了新的机遇, 但仍然面临政策法规和技术优化两方面的挑战。目前, 国际上对基因编辑作物是否属于转基因生物尚未有明确一致的定论, 其监管标准也存在较大争议。美国农业监管部门认为基因编辑作物 (genome edited crop, GEC) 是通过细胞自我修复机制而产生的突变体, 与作物自然突变以及物理和化学诱导突变极其相似, 都是少数几个核苷酸的改变, 因此, GEC不被定义为GMO。欧盟对GMO监管较为严格, 其认为只要有外源DNA转入, 而不论最终植物中是否还存在外源DNA, 都被定义为GMO。从科学角度来讲, 基因编辑诱导的突变与自然突变以及物理和化学诱导突变性质一样, 实质无法区分, 因此欧盟也有建议将GEC定义为非GMO。但基于政治考虑, 欧盟尚未下明确定论, 对GEC的监管标准存在不确定性。目前, 中国对于基因编辑作物的监管标准尚无明确的规定, 因此亟需出台相关的政策法规以正确引导基因编辑育种。

  硼是植物必需的微量营养元素,甘蓝型油菜需硼多,对缺硼非常敏感,是我国油菜生长受限的主要原因之一。2016年该课题组在Plant, Cell & Environment报道了甘蓝型油菜硼高效基因BnaA3.NIP5:1的克隆,但其调控机制尚不清楚。目前国际上只报道了WRKY6参与缺硼反应,其分子机制仍有待挖掘。

  在本研究中,该课题组发现WRKY转录因子家族基因受缺硼诱导表达,在此基础上构建了BnaA9.WRKY47的CRISPR/Cas9突变体材料和35S启动的超表达材料,研究发现BnaA9.WRKY47突变体材料对缺硼更加敏感,硼含量降低;而超表达材料对缺硼的适应性增强,硼含量升高。与表型和硼含量相一致的是,低硼条件下,硼高效基因BnaA3.NIP5;1在BnaA9.WRKY47突变体中表达量下降,而在BnaA9.WRKY47超表达材料中表达量升高。通过酵母单杂、EMSA、烟草瞬时表达以及原位杂交等实验分析,证明BnaA9.WRKY47通过结合BnaA3.NIP5;1启动子区域的特异序列直接激活了BnaA3.NIP5;1的表达。由此,首次证实转录因子BnaA9.WRKY47通过上调硼高效基因BnaA3.NIP5;1的表达,来提高油菜抗低硼胁迫能力的调控机制。

  该研究由国家自然科学基金和中央高校基本科研业务费专项基金资助,华中农业大学博士研究生冯英娜为本文的第一作者,徐芳森教授为通讯作者。

  原花青素是植物界广泛存在的一类多酚次级代谢产物,对植物生理和人体健康均发挥着重要作用。对植物而言,原花青素可以抵御各种生物和非生物胁迫,如紫外伤害、机械损伤和真菌侵染等。对于人类来说,原花青素能够清除自由基,增强免疫力、减少癌症等各种疾病的发生。因此,原花青素作为果实品质的重要组成部分,解析其积累及调控机制,对于果实品质的改良具有重要的理论和实践意义。

  柑橘是世界第一大水果,其丰富的种质资源为果实品质形成调控机制研究及品质改良奠定了材料基础。本研究通过对原花青素差异积累的“暗柳”“红暗柳”和“埃及糖橙”甜橙的种子及幼果进行转录组测序,发现转录因子CsPH4和Noemi与柑橘原花青素的积累高度相关。研究表明,在柑橘愈伤组织和拟南芥中超表达CsPH4和Noemi,两个转录因子均能诱导原花青素途径基因上调表达,从而促进原花青素的积累。在研究中,在超表达CsPH4的柑橘愈伤组织中还观察到Noemi被显著诱导表达。随后的生化实验进一步证实了CsPH4和Noemi能够相互作用形成复合体,直接结合到原花青素途径基因启动子的MRE元件从而激活其表达,同时该复合体也可与Noemi启动子直接结合,诱导Noemi上调表达,进一步促进原花青素的积累。

  该项研究成果丰富了人们对植物原花青素积累及转录调控机理的认识,完善了柑橘原花青素积累的调控机理,为柑橘果实品质改良奠定了理论基础。

  该研究得到国家重点研究计划项目和国家自然科学基金的资助。园艺林学学院博士研究生张印为该论文第一作者,邓秀新教授为论文通讯作者。